ADN antiguo y su estudio en el campo de la Arqueología
Hace tiempo que quería escribir un artículo sobre el trabajo que se está realizando en el campo del ADN antiguo, tanto por parte de los científicos relacionados con esta disciplina como por el trabajo de los arqueólogos para poder facilitar esta labor. De este tema hay muchos trabajos, y muy buenos, así que esta es una pequeña aportación. Gracias a mis amigos de esta página por su interés en el tema y sobre por su paciencia!!. Us estimo molt!
Indice
1-INTRODUCCIÓN
2-DATOS GENÉTICOS
2.1.ADN NUCLEAR
2.1.1.ADN DEL CROMOSOMA Y
2.2.ADN MITOCONDRIAL
3-CONSIDERACIONES A LA HORA DE TRABAJAR CON ADN ANTIGUO
3.1.ANTIGUEDAD ALCANZADA
3.2.CRITERIOS DE AUTENTICIDAD
3.2.1.NORMAS DE TRABAJO EN LA ETAPA DE LA EXCAVACIÓN
3.2.2.NORMAS DE TRABAJO EN LA ETAPA DEL ANÁLISIS
4-MÉTODOS
4.1.EXTRACCIÓN DEL ADN
4.2.ANÁLISIS
4.3.SECUENCIACIÓN
5-PROBLEMAS Y LIMITACIONES DEL ESTUDIO DEL ADN ANTIGUO
6-APLICACIONES DE LOS ESTUDIOS DE ADN
7-CASO CONCRETO DE LA ESTIMACIÓN DEL SEXO EN RESTOS OSEOS HUMANOS UTILIZANDO ADN ANTIGUO
8-CONCLUSIÓN
9-BIBLIOGRAFIA
1-INTRODUCCIÓN
Durante muchos años, paleontólogos y arqueólogos coleccionaron restos humanos, animales y plantas de distinta antigüedad. El estudio de esos restos antiguos se realizó inicialmente en base a la morfología de las especies.
La arqueología molecular es un campo producido por el auge en el estudio del ADN. Este tipo de estudio es particularmente interesante porque el ADN es el reservorio de la información genética de un organismo y representa una clave directa de la evolución.
El gran avance de las técnicas de biología molecular ha permitido recuperar y estudiar moléculas de ADN antiguo (ADNa) a partir de restos arqueológicos, fundamentalmente restos óseos y piezas dentales.
El ADN es la molécula en la que se encuentra codificada toda la información genética de los organismos. Esto hace posible que analizando su ADN pueda determinarse la especie a la que pertenecen e incluso conocer algunos de sus rasgos individuales.
Se considera ADN antiguo (ADNa) al recuperado de restos biológicos preservados natural o artificialmente. La extracción de ADN procedente de algunos animales extintos y de tejidos momificados, en la década de los 80, supuso el comienzo de las investigaciones en ADN antiguo (ADNa). La publicación de los artículos de Higuchi (1984) y Pääbo (1985) en Nature demostraron, mediante clonación bacteriana, que algunos fragmentos de ADN podían sobrevivir a los procesos autolíticos y diagéneticos en los tejidos preservados, pero en contrapartida también demostraron que el material genético que sobrevive en especímenes antiguos principalmente, era procedente de hongos y bacterias y que el ADN endógeno estaba en cantidades muy bajas, por lo que esta metodología reveló ser ineficaz.
El segundo gran paso fué la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa, escrita también bajo las siglas PCR (polymerase chain reaction). Está ayudo a solventar los problemas de la escasez y el daño molecular del ADN obtenido, haciendo posible la reproducibilidad de los resultados (Pääbo y Wilson, 1988).
Otro paso importante lo constituyó el descubrimiento de que en los tejidos duros también podían conservarse pequeños fragmentos de ADN. Los restos esqueléticos constituyen el material más abundante del registro fósil, y el ADN extraído presenta una mayor calidad que en muestras de tejido blando.
Como resultado de esta combinación de factores, así como la mejora en el procesamiento de los datos genéticos obtenidos., ADNa es un campo preparado para ofrecer grandes resultados científicos.
2.-DATOS GENÉTICOS
Una gran cantidad de información deductiva sobre la evolución humana se puede reconstruir a partir del ADN .El ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético que se encuentra en todas las células del cuerpo humano. Es el componente químico primario de los cromosomas, material del cual están formados los genes. Puede almacenarse en diferentes zonas de la célula. Su estructura consiste en una hélice formada por una doble cadena en la que los eslabones serían unas unidades químicas denominadas nucleótidos. Los nucleótidos están constituidos por tres componentes: un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada. Existen cuatro nucleótidos distintos A (adenina), C (citosina), G (guanina) o T (timina). Por tanto, puede decirse que el alfabeto del ADN está compuesto por cuatro letras cuya combinación a lo largo de la molécula puede dar lugar a infinidad de secuencias distintas. El orden o secuencia en que se disponen los diferentes nucleótidos a lo largo de la cadena determina la información genética.
En esa doble cadena hay unas reglas fijas de complementariedad: la A de una cadena siempre se aparea con la T en la cadena complementaria (mediante dos puentes de hidrógeno) y la C siempre se aparea con la G (mediante tres puentes de hidrógeno). Esto permite que conociendo la secuencia de una de las cadenas pueda deducirse la de la cadena complementaria
Dibujo de la disposición de nucleótidos en la doble cadena de ADN
La unidad vital básica es la célula. Un ser humano está compuesto por un promedio de aproximadamente 100 billones de células, las cuales se originaron a partir de una única célula: el cigoto, originado por la fertilización de un óvulo por un espermatozoide.
En una célula humana, el ADN se localiza principalmente en el núcleo, aunque también existe una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias.
Dado que el ADN se copia repetidamente, en especial cuando se transmite de padres a hijos, se produce errores de copia y, si estos cambios no son letales, estas mutaciones también son copiadas. Las mutaciones se acumulan en el tiempo y permiten seguir líneas concretas de evolución genética, y estimar el tiempo empleados en su acumulación.
La célula y distintos orgánulos
2.1.-ADN NUCLEAR
Es el ADN que forma los cromosomas típicos y se encuentra en el núcleo. Contiene los planes de la mayoría de nuestras estructuras corporales y se hereda una combinación del de nuestros dos padres. Este tipo de ADN nos puede dar información sobre las relaciones evolutivas.
El genoma humano nuclear consiste en 22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales, X e Y, cuya combinación determina el sexo femenino (XX) o masculino (XY). En conjunto, cada célula somática contiene 46 cromosomas.
Cromosomas humanos
Un ejemplo es un análisis de la variabilidad global en un segmento de ADN nuclear del cromosoma 12 llamado locus CD4 (posición que ocupa una determinada secuencia de ADN en el cromosoma) y muestra que la poblaciones africanas presentan muchos patrones de variación diferentes, mientras que las del resto del mundo tienen, básicamente, un solo patrón.
2.1.1 ADN DEL CROMOSOMA Y
El cromosoma Y es uno de los cromosomas humanos más pequeños, sólo superado por el cromosoma 22. Únicamente va a estar presente en el género masculino y determina genéticamente el sexo masculino. El cromosoma Y se transmite del padre a sus hijos varones en bloque, de generación en generación, sin apenas variación y es un excelente marcador para seguir a través de la historia los diferentes linajes paternos. Gracias a los avances de la biología molecular, es posible determinar las distintas variantes de cromosoma Y, mediante el análisis de unas secuencias cortas de ADN que se repiten en tándem un número determinado de veces, denominadas STR (Short Tandem Repeat), a fin de obtener información acerca del origen étnico y/o geográfico de los individuos.
Su empleo en estudios de ADN antiguo es todavía muy restringido por motivos técnicos que tienen que ver con su escasez, dado que únicamente existe una copia de cromosoma Y por célula.
2.2.-ADN MITOCONDRIAL (ADNmt)
El ADN mitocondrial es el material genético de las mitocondrias, los orgánulos que generan energía para la célula. El ADNmit es heredado a través de línea materna, aunque tanto hombres como mujeres tienen ADN mitocondrial, únicamente éstas últimas lo transmiten a su descendencia. Esto es por el elevado número de moléculas de ADNmit que existe en los óvulos (100.000 - 200.000 copias) en comparación con unos pocos cientos del espermatozoide.
El ADNmit ha sido de gran ayuda para los antropólogos moleculares, pues a través de él se ha conseguido dilucidar cada vez más sobre filogenia y evolución utilizándolo como marcador molecular, dado que presenta una alta tasa de mutación en comparación con el genoma nuclear, lo cual permite mayor resolución en escalas cortas de tiempo; de este modo, se ha utilizado para establecer el linaje de todos los seres humanos, así como para estudiar animales extinguidos, o para el estudio de otros restos antiguos. También es utilizado en los casos en que la cantidad de ADN nuclear es muy pequeña o las muestras están muy degradadas pues su localización en el interior de las mitocondrias (factores que lo hacen más resistente a agentes externos), hacen del ADNmt un candidato ideal para el análisis de este tipo de muestras.
En genética antropológica inicialmente se estudiaba sólo el primer segmento hipervariable (HVS-I) pero ahora se está ampliando el análisis a todo el genoma mitocondrial. El proyecto llamado “Genographic Project” está estudiando las huellas de ancestrales migraciones humanas dejadas en este ADN. Se ha creado una base de datos pública de ADN mitocondrial que contienen ya 78.590 genotipos de humanos.
En el campo de la zoología, en el año 2001, Copper et al. , completó el genoma mitocondrial del Moa (especie extinta procedente de Nueva Zelanda) Se estudió la relación filogenética de las moas (aves gigantes con otras especies voladoras y no voladoras de Australia y Sudamérica). Mediante la obtención de secuencias de ADNmt de especímenes de cuatro especies de moas, una de ellas de 3500 años de antigüedad, se demostró que las moas estaban más relacionadas con los emúes australianos y con los casuarios que con los Kiwis.
En el 2006 el grupo de investigación liderado por Krauser J. completó el genoma mitocondrial del Mamut, viendo que esté se encuentra más relacionado con el elefante asiático que con el africano.
Rouffignac Cave,Dordoge,France
3-CONSIDERACIONES A LA HORA DE TRABAJAR CON ADN ANTIGUO.
3.1. ANTIGÜEDAD ALCANZADA.
La antigüedad máxima de la preservación del ADN es de vital interés, ya que impondrá los límites de los trabajos a realizar. Se han publicado diversos trabajos donde se habla de recuperación de ADN de millones de años de antigüedad; estos trabajos actualmente no están aceptados por la comunidad científica, ya que no ha sido posible reproducir esos resultados.
Después de la muerte, las moléculas biológicas empiezan a ser degradadas por las enzimas endógenas, y por organismos exógenos, además del daño provocado por las condiciones ambientales a las que el organismo haya estado expuesto. No obstante, aunque las biomoléculas se alteren en forma, sus componentes pueden persistir por largos períodos de tiempo.
Condiciones que favorecen la preservación del ADN:
- Una rápida deshidratación disminuye el daño hidrolítico.
- Condiciones anaeróbicas.
- Fuerzas iónicas altas.
- Presencia de taninos o ácidos húmicos del suelo.
- La asociación con proteínas cromosómicas u otras moléculas biológicas pueden favorecer la perservación del ADN, y pueden retardar la actividad degradativa por parte de los microorganismos.
Podemos ver que las condiciones ambientales específicas son las que favorecen una mayor preservación, más que la edad del mismo.
Sin embargo, la forma de preservación más importante del ADN es en los dientes y en los huesos, Muchos estudios han mostrado que los huesos pueden soportar condiciones ambientales extremas y luego permitir que su ADN sea correctamente caracterizado mediante técnicas que hacen uso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
El análisis del ADN antiguo es posible gracias a la gran sensibilidad de la PCR, esta misma sensibilidad es también la causa de grandes problemas técnicos, como por ejemplo, la amplificación de trazas de ADN moderno introducido como contaminante y su amplificación inadvertida en vez del ADN antiguo, por lo que se requieren rigurosas prácticas de laboratorio, personal calificado, experimentos control y pruebas de verificación en todos los pasos.
3.2.CRITERIOS DE AUTENTICIDAD.
La autenticidad de un resultado es la prueba de que las secuencias de ADN recuperadas de muestras antiguas provienen del espécimen analizado y no de cualquier otra fuente. Todo este tema como vemos, está relacionado con la contaminación, pero el problema de la autenticidad también tiene que ver con el daño post-mortem, que puede producir una secuencia diferente de la secuencia que presentaba e realidad el espécimen en vida. Cuanto mayor sea la importancia de la muestra analizada o su relevancia, más riguroso deben ser los criterios aplicados para su autentificación. La contaminación de la muestra con ADN exógeno es el gran problema con el que se enfrentan los científicos que trabajan con ADNa. Las etapas donde se puede producir esa contaminación son:
- En el mismo lugar del yacimiento.
- Durante la excavación, por parte del personal arqueológico.
- En el museo donde se expone o almacena la muestra.
- Durante el análisis en el laboratorio.
Por todo ello se han intentado establecer unos criterios de autenticidad .
3.2.1.NORMAS DE TRABAJO EN LA ETAPA DE LA EXCAVACIÓN.
- En lo posible, deben seleccionarse piezas esqueléticas limpias y sin fisuras
- Durante la exhumación y procesamiento de las muestras, usar guantes y máscara y utilizar instrumental límpio o de un solo uso.
- Dejar secar el material que esté húmedo en una habitación aislada antes de guardarlo,para evitar la proliferación de microorganismos.
- Guardar la pieza una vez límpia con sustancias apropiadas, en el interior de recipientes estériles.
3.2.2.NORMAS DE TRABAJO EN LA ETAPA DEL ANÁLISIS
a) Aislar las áreas de trabajo.
El trabajo debería realizarse separando las áreas de trabajo, dependiendo de cada una de las fases del análisis (extracción, amplificación y análisis posteriores). La separación logística es imprescindible y en el caso de que esta no pueda hacerse, se procederá a la separación temporal, realizando cada uno de los procedimientos en días distintos. También se debe minimizar la manipulación de las muestras.
b) Controles negativos y amplificaciones.
Verificar mediante controles negativos o “blancos”, la no presencia de contaminación en los procesos de extracción y amplificación, aunque estos controles sólo serán útiles en un contexto integrado de autentificación
c) Cuantificación
En el caso de la obtención de ADNa a partir de huesos, el ADN recuperado es predominantemente de bajo peso molecular y puede arrastrar impurezas que den auto fluorescencia bajo luz ultravioleta a longitudes de onda de 260-280nm,realizando la cuantificación por espectrofotometría o por tinción de bromuro de etidio.
d) Reproducibilidad
Deberán ser analizados las muestras por los menos por duplicado y los resultados deberán ser concordantes, pero tampoco la reproducibilidad descartará del todo una contaminación extensa, por lo que como hemos comentado antes, tiene que estar todo en el contexto.
e) Clonación
Los productos de la amplificación mediante la PCR (amplicones), deben ser clonados y los diversos clones obtenidos secuenciados para poder evaluar la homogeneidad del ADN amplificado. Un problema de seguir este criterio es que hace casi impracticables los estudios a nivel poblacional, debido a lo costoso del estudio, por lo que si la muestra obtenida, cuantificada y secuenciada directamente está muy conservada, no hace falta cumplir estrictamente con este criterio.
e) Replicación independiente
Es conveniente que los análisis se realizaran en laboratorios independientes, por grupos distintos.
f) Restos asociados
La contaminación de la muestra con ADN exógeno es el gran problema con el que se enfrentan los científicos que trabajan con ADNa. Las etapas donde se puede producir esa contaminación son:
- En el mismo lugar del yacimiento por parte de restos de microorganismos,hongos y fauna.
- Durante la excavación, por parte del personal arqueológico
- En el museo donde se expone o almacena la muestra
- Durante el análisis en el laboratorio.
4-MÉTODOS
4.1.EXTRACCIÓN DEL ADN
Los métodos para la extracción, detección, amplificación y análisis del ADN antiguo están basados, en su mayoría, en los métodos que se utilizan para analizar ADN moderno, con algunas modificaciones para adaptarlos a las características del propio ADN.
La extracción de ADNa es el paso más crucial de todo el proceso. Una decisión equivocada puede reducir e incluso destruir toda la información que ha estado conservada a través del tiempo. A pesar de la importancia de las técnicas de extracción, ha habido muy poco debate sobre cual es el método más apropiado. Esto es curioso, dada las grandes controversias que hay en otros estadios del análisis del ADNa.
De manera resumida, se enumeran los pasos generales a seguir:
- Eliminar agentes conservantes/descalcificación
- Digestión de proteinas
- Extracción del ADN
- Purificación y concentración
Como ejemplo, en el caso de huesos, que son la fuente mayoritaria de restos donde se puede intentar recuperar ADN, la mayoría de los métodos de extracción implican la pulverización del hueso, pero antes se elimina la superficie del fragmento óseo frotándolo suavemente con una lija estéril de tal forma que se eliminan las posibles contaminaciones de ADN actual por contacto. A continuación, se limpia con una solución de hipoclorito de sodio al 5%. A continuación se procede a su descalcificación con EDTA. La descalcificación se usa por los siguientes motivos:
A) El polvo del hueso es muy grande a escala celular.
B) La doble hebra de ADN tiene fuerte afinidad por la hidroxiapatita y debe ser removida para recuperar el ADNque contiene.
C) Los colorantes contaminantes que tienden a precipitarcon el ADN y causan inhibiciónde la PCR son eliminados con la descalcificación.
Pero existen publicaciones que discuten el tema de la utilización de la descalcificación o no, dejando el debate abierto de cual es la mejor opción.
4.2.ANÁLISIS
Después de obtener ADN, se procede a su análisis, que es lo que verdaderamente nos dará la información que buscamos, dependiendo del estudio que se vaya a realizar
Estos análisis están explicados brevemente de manera cronológica, dado que también en este campo se ha ido avanzando, intentando eliminar los errores que se iban generando y las limitaciones de cada uno de ellos.
CLONACION BACTERIANA
La clonación del ADN permite obtener múltiples copias de un fragmento de ADN al insertarlo en un elemento génico autorreplicable (plásmido: molécula circular de ADN) y, mediante un choque térmico, se introduce dentro de bacterias. Cada bacteria recibe una única cadena del ADN amplificado que se inserta en su genoma.
Los factores limitantes son que se ve afectada por el daño molecular, que impide la integración del ADN en las bacterias y que el mecanismo de reparación de las bacterias puede introducir cambios en el ADN.
Un ejemplo de este tipo de metodología es el estudio que realizó Svante Pääbo con ADN extraído de tejido blando procedente de una momia egipcia. Para ello realizó un arduo estudio en 23 momias egipcias sobre la preservación de ADN en cada una de ellas y en la momia de un niño halló en las células de la epidermis y otras estructuras subcutáneas ADN en buenas condiciones para abordar su clonación, mediante un vector o plásmido bacteriano demoninado pUC8.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(“Polymerase Chain Reaction", PCR)
La técnica de la PCR se utiliza para amplificar regiones del ADN, lo que permite obtener perfiles a partir de cantidades mínimas de material genético. Mediante la utilización de este proceso se producen millones de copias de segmentos seleccionados de regiones variables de ADN, usualmente fragmentos cortos que se pueden utilizar para obtener perfiles. Está técnica permite amplificar el ADN con bastante eficacia a partir de muy pocas moléculas originales. Gracias a esta técnica se superaron los problemas de la clonación. Sin embargo, el enorme poder de amplificación de la PCR también crea e incrementa la sensibilidad de contaminación de ADN moderno y simultáneamente, una mayor fuente de falsos positivos, por ello se han pautado unas estrictas normas y procedimientos para evitar la contaminación con ADN exógeno.
Son esenciales para el proceso de amplificación varios componentes, que se van adicionando en un eppendorf (tubo)
-Solución tampón conteniendo habitualmente Tris, MgCl2 y KClLa Taq polimerasa necesita los iones Mg2+ liberados por este en la reacción para su actividad, rendimiento y especificidad. La concentración ensayada es de 1x
- Primers o cebadores
Oligonucleotidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos complementarios a la zona flanqueante de la región que se quiere amplificar. Los primers actúan como marcadores del sitio de inicio de la enzima. Las concentraciones de primers varia dependiendo el experimental, aunque normalmente pueden oscilar entre 2µM-0.1µM
-dNTP
Nucleotidos que servirán de sustrato con los que sintetizar las nuevas cadenas de ADN. Es una solución de alta pureza en deoxiribonucleosidos trifosfatos Normalmente su concentración final es de 0.2mM
-Enzima Polimerasa termoestable
Enzima aislada del una bacteria (Termophilus acuaticus), que es capaz de incorporar nucleótidos libres en el extremo 3’ del primer unido a la cadena principal; formando así una cadena complementaria, la enzima tiene la característica de soportar temperaturas. Su concentración suele oscilar entre 1 y 2.5 U
- ADN molde
Muestra que se ha extraído de la pieza a analizar
La reacción se divide en tres fases y estás se repiten de forma cíclica con un número aleatorio de ciclos
Desnaturalización Mediante elevación de la temperatura a 94-95 º C las dos cadenas de la doble hélice de ADN molde se separan, quedando en forma de cadena simple.
Hibridación Al disminuir la temperatura a 50-60 ºC, los cebadores se unen al ADN molde justo en el lugar de sus secuencias complementarias
Extensión El calentamiento a 72 ºC permite la extensión de la cadena de ADN a partir de los cebadores mediante la adición sucesiva de nucleótidos tomando como referencia la secuencia del ADN molde
Todo este proceso se repite número de ciclos determinados (entre 25-35). En cada ciclo se produce un incremento exponencial en el número de copias. El aparato que facilita todo este proceso se llama Termociclador.
Esquema del proceso de amplificación por PCR
4.3.SECUENCIACIÓN
Es el método que permite conocer la secuencia de nucleótidos que conforman el fragmento que interesa analizar. La secuenciación puede ser directa, se analiza el producto obtenido mediante la PCR sin ningún tratamiento adicional; o bien mediante clonación de los fragmentos obtenidos en la amplificación. Está última es la más aprobada, ya que así se detectarían posibles daños moleculares y errores en la amplificación, el problema es que esto conlleva analizar múltiples clones de una misma muestra, lo que incrementa el trabajo a realizar.
En el caso de que se halla amplificado ADN mitocondrial humano, las secuencias obtenidas se comparan con secuencias homólogas consignadas en la base de datos de ADN mitocondrial humano mediante programas informáticos
Ejemplo de una secuencia obtenida por le método automático de secuenciación.
5-PROBLEMAS Y LIMITACIONES DEL ESTUDIO DEL ADN ANTIGUO
La obtención y el análisis de ADN a partir de restos antiguos presentan diversos problemas metodológicos que hacen que no siempre sea posible. A continuación expondremos los más importantes
1. Degradación del material genético
Debido al proceso de degradación molecular que empieza después de la muerte de un organismo, el ADN puede presentar fragmentaciones y daño molecular. El proceso de fragmentación es producida por hidrólisis, ocasionando hasta fragmentos de pequeño tamaño, generalmente menores de 500 bp (pares de nucleótidos)
Las condiciones ambientales son de vital importancia en la conservación del ADN. A temperaturas altas, la velocidad de las reacciones químicas responsables de la degradación orgánica aumenta. En lo que se refiere a la humedad, un exceso tiene un efecto adverso, que favorece las reacciones de degradación. Por ello el ADN dañado puede interferir la hibridación con sondas específicas de especie, pudiendo dar resultados erróneos.
2. Inhibidores de la PCR
El ADN antiguo tiene la particularidad de tener sustancias que inhiben la reacción enzimática de la PCR, considerada como la herramienta fundamental para el estudio del ADNa.
La naturaleza de estos inhibidores es aún desconocida y probablemente esta inhibición sea multifactorial, y que cada tipo de muestra pueda contener una sola sustancia inhibitoria o una combinación de ambas. Distintos autores han propuesto distintas sustancias inhibitorias, dependiendo del tipo de extracto analizado, desde compuestos del suelo como los ácidos húmicos o fúlvicos, residuos de porfirinas, Colageno tipo I y hasta que la inhibición es debida al extenso daño que presentan las moléculas antiguas.
3. Contaminación
Este es el mayor de los problemas a la hora de trabajar con material genético. La extrema sensibilidad de la técnica de la PCR. Si el extracto se contamina con una mínima cantidad de ADN exógeno, este último también podría ser amplificado. Este apartado ya ha sido mencionado largamente durante todo el texto.
6-APLICACIONES DE LOS ESTUDIOS DE ADN
Las aplicaciones de los estudios de ADNa en el campo de la arqueología pueden ser las siguientes:
-Identificación personal y diagnostico molecular del sexo
La tecnología del ADN antiguo ha surgido como una poderosa herramienta para la identificación individual especialmente en casos donde el tejido blando está severamente descompuesto o dañado. Así, muchos restos humanos que consistían solamente en huesos y piezas dentales, han sido identificados exitosamente por diferentes metodologías de ADN.
En el caso del diagnostico molecular del sexo, este estudio tiene interés en los casos en los que la preservación de los restos no permita la determinación morfológica, por ejemplo en piezas esqueléticas aisladas y en individuos infantiles, en los que todavía no se han definido las diferencias sexuales a nivel anatómico
-Establecimientos de vínculos familiares
Determinar las relaciones familiares entre individuos exhumados puede ayudar en la comprensión de los patrones sociales de enterramiento de una población (necrópolis y enterramientos múltiples). La limitación es que hay que contar con un marco de referencia de la variabilidad genética de la población, lo que a menudo no es posible debido a la falta de disponibilidad de los restos humanos necesarios.
Se han realizado estudios para la identificación de personajes con importancia histórica, como el caso de los hijos putativos de Luis XVI, o los miembros de la familia Romanov.
-Epidemiología
Caracterización genética de virus y bacterias. Este análisis permite ver la evolución de los patógenos en el tiempo y determinar la incidencia de enfermedades infecciosas y la evaluación de enfermedades en las poblaciones antiguas.
En el ADN de restos antiguos se pueden buscar mutaciones puntuales que den origen a enfermedades genéticas. Se han realizado estudios de detección de ADN de agentes infecciosos como por ejemplo tuberculosis, sífilis, infecciones por hongos, que dejan también una huella morfológica, así se podrá realizar previamente una selección de las muestras.
Esta información deriva en la mayoría de los casos, de las colecciones que poseen los museos de distintas especies.
-Caracterización genética de poblaciones del pasado
La estrategia fundamental de las investigaciones filogenéticas para entender los procesos evolutivos de las diferentes especies, consiste en diseñar estudios comparativos del ADN moderno en poblaciones actuales y la caracterización de material hereditario antiguo para detectar homologías en la secuencia genética de esta manera se puede comparar fragmentos amplificados con fragmentos semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos.
Además permite construir una cronología de eventos en la evolución y migración.
Se han realizado estudios para aclarar el origen de los japoneses, de los indígenas americanos, de los vascos, de las poblaciones talayóticas de Mallorca, el estudio de poblaciones antiguas africanas. Pero entre los estudios que han tenido mayor relevancia dentro del campo de la antropología destaca la caracterización genética del hombre de Neandertal
-Zoología y Botánica
Los estudios de ADN antiguo en el campo de la zoología han servido para esclarecer las relaciones filogenéticas de especies extinguidas como el Cuagga (Higuchi et al. 1987), las Moas (Cooper et al. 1992) y también puede servir para dilucidar la ecología de estos animales, determinando la especie de plantas y organismos que constituyeron su dieta.
Estudios parecidos se han establecido en el campo de la botánica.
El estudio de restos de plantas y animales relacionados con el hombre, puede ayudar en temas relacionados con el origen de su utilización y domesticación
Último ejemplar de Cuagga (1883)
7-CASO CONCRETO DE LA ESTIMACIÓN DEL SEXO EN RESTOS ÓSEOS HUMANOS UTILIZANDO ADN ANTIGUO
La posibilidad de recuperar material genético de restos óseos y dentarios abre la posibilidad de estimar el sexo a partir del ADN de los cromosomas X e Y. El estudio se basa en la amplificación del gen de la amelogenina (AMG), que presenta una deleción diferencial, es decir, este gen presenta tamaños diferentes según esté localizado en el cromosoma X o Y.
La amelogenina es la proteína de mayor concentración del esmalte dental durante el desarrollo. En el humano existen dos genes para esta proteína. Uno de ellos se localiza en el cromosoma X, llamado “AMELX” cuyo tamaño es de 2872pb y el otro en el cromosoma Y, llamado “AMELY” siendo su tamaño de 3272pb.
Según Sullivan et al., se generan mediante amplificación por PCR dos fragmentos cuyos tamaños son de 106 y de 112pb, debido a una deleción de 6pb del gen AMELX. El cromosoma X es el control interno que siempre debe amplificar
La metodología que se expone está extraída del artículo de Jesús Salvador Velarde-Felix y colaboradores. “Identificación del sexo mediante análisis molecular del gen de la amelogenina”
Rev. Mex. Patol. Clin, Vol.55, Num. 1,pp 17-20. 2008
Se diseñan dos primers de unos 23-24pb que abarquen la región que queremos amplificar de cada uno de los genes.
Se obtiene ADN, cuantificando su cantidad y su calidad, imprescindible estos dos parámetros antes de comenzar la amplificación.
Se procede a preparar una mezcla de reacción conteniendo ADN, primers, Tampón de ensayo, dNTP y el enzima Taq Polimerasa que iniciará todo el proceso. Se establecen los parámetros de temperatura y ciclos para la amplificación por PCR.
Las muestras de origen masculino (XY) mostraran dos bandas sobre un gel de agarosa (una para el fragmento de 106 bp y otro para el fragmento de 112 bp), mientras que las de origen femenino (XX) mostraran una sola banda. Es una prueba relativamente fiable, económica y rápida para poder determinar el sexo.
El carril nº 1 pertenece a un hombre, dado que aparecen dos bandas bien definidas. En carril 2 y 3 el resultado es de mujer, El carril 4 es el control de contaminación (no debe aparecer ninguna banda) y el 5 pertenece al marcador de peso molecular.
En las dos siguientes páginas aparece la secuencia completa de cada uno de los genes.
8-CONCLUSIONES
La preservación del ADN en los restos hallados y su posible contaminación es uno de los condicionantes que impide normalmente el éxito en los estudios, pero el concepto de aplicar a partir ya del momento del hallazgo de los criterios de autenticidad hará que cada vez los resultados aportado por esta disciplina sean de mayor rigor científico.
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Software DNAStar
escrito por Irene, 20 09, 2009
agradecida por compartir lo que sabes. Musuak.
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Mi intención al escribir el artículo era sobre todo hacerlo lo más ameno posible, ya que todos somos de disciplinas distintas, y a veces el hacerte entender es complicado. Así que me llena de satisfacción tus palabras :-)
El libro que comentas si que lo he leído, es muy bueno, escrito por uno de los genetistas con más proyección que tiene el campo del ADN ,Bryan Sykes. Ha publicado numerosos trabajos en eta disciplina, tanto trabajando con adn mitocondrial como adn del cromosoma Y, y sus trabajos han sido corraborados con otros prestigiosos nombres de este campo, lo que ya es una garantia.
El libro a mi me pareció muy didactico y consigue (es opinión personal) que un tema complicado, llegue de una manera muy coloquial.
El libro de las 7 hijas de Eva es un estudio experimental, basado en resultados obtenidos después de multiples análisis y alineaciones de secuencias, y el concepto de la Eva mitocondrial lleva en discusión muchos años, reafirmandose ultimamente al haber conseguido mejorar los programas informáticos que se utilizan para reconstruir los arboles genealógicos.
En resumen, libro totalmente recomendable.
De quién descendemos.....De Helena? ;-)
Petonets y mil gracias por tu comentario.